Screening natural resources for mineralogenic and osteogenic bioactivities using in vitro and in vivo fish systems

Dissertação de Mestrado, Biologia Marinha, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2016Bone disorders affect millions of people worldwide, and available treatments have only a limited efficacy and/or bring undesirable side effects. There is therefore the need for novel compounds with bone anabolic properties. Due to its technical advantages, fish have been successfully used in biomedical and pharmaceutical research to screen for osteogenic compounds. The aim of this work was to evaluate mineralogenic/osteogenic performance of semi-purified fractions and purified molecules from terrestrial plants (cardoon and eucalyptus) and cyanobacteria. VSa13 cell line established from gilthead seabream (Sparus aurata) vertebra and capable of in vitro mineralization was used to assess the mineralogenic potential of the extracts, while zebrafish operculum was used to develop and establish a reliable in vivo model to screen molecules for osteogenic activity. Extracts from cardoon, eucalyptus and some cyanobacteria exhibited some moderate mineralogenic effect while triterpenic acids purified from eucalyptus strongly increased mineral deposition. Pro-mineralogenic compounds were further analysed for their bone anabolic action on zebrafish operculum and lipophilic cardoon extract, ursolic acid, oleanolic acid and ethyl acetate fraction of cyanobacteria strain #13 were found to promote an osteogenic effect. While the osteogenicity of ursolic acid has already been reported in mouse, the action of oleanolic acid and cyanobacteria extract on bone formation is revealed here for the first time. The use of a double transgenic line expressing fluorescent proteins under the control of osterix/sp7 and osteocalcin/oc2 promoters to get insights into mechanisms underlying the osteogenic activity of natural compounds has been explored. In vitro and in vivo data generated within the scope of this work have not only demonstrated the potential of natural resources to provide molecules with mineralogenic/osteogenic activity that may be used in pharmaceuticals or nutraceuticals but also the suitability of fish systems to screen for these molecules.O tecido ósseo é um tipo especializado de tecido conjuntivo constituído por células e por uma matriz extracelular, que possui como característica única a capacidade de promover a sua mineralização,, o que confere a este tecido uma extrema dureza, permitindo-lhe desempenhar importantes funções quer de suporte mecânico aos músculos, possibilitando o movimento, quer de proteção de órgãos internos, constituindo também uma reserva de iões de cálcio e de fosfato. As patologias mais importantes que afectam o esqueleto incluem doenças metabólicas, que afectam o crescimento através de alterações na formação e remoção óssea, fracturas, deformações várias,, infecções bacterianas e tumores. Entre as doenças metabólicas que afectam milhões de pessoas em todo o mundo e que resultam do desequilíbrio entre a atividade osteoblástica (formação óssea) e a atividade osteoclástica (reabsorção óssea) estão a osteoporose, a osteopetrose, o raquitismo e a doença óssea de Paget. No entanto os tratamentos usados são ineficazes e/ou estão associados a efeitos secundários indesejáveis existindo a necessidade de descobrir novos compostos com a capacidade de reverter os sintomas dessas patologias no osso. Os recursos naturais representam uma fonte valiosa de moléculas bioativas, em particular de compostos osteogénicos. A análise em grande escala de extratos ou moléculas com potenciais efeitos osteogénicos requer o uso de ferramentas in vitro e in vivo optimizadas Organismos aquáticos como o peixe-zebra (zebrafish) têm sido utilizados com sucesso nas investigações biomédica e farmacêutica devido às suas vantagens técnicas em relação a modelos animais mais clássicos, como o ratinho. Por exemplo o peixe-zebra possui um ciclo de vida mais curto, gera um elevado número de descendentes, tem o genoma sequenciado, os embriões são transparentes e desenvolvem-se externamente. Além disso, os peixe-zebra adultos também podem ser facilmente visualizados e manipulados experimentalmente e existem mutantes/transgénicos que permitem a análise da expressão de multiplos genes através de microscopia de fluorescência. O objectivo principal deste trabalho é avaliar a capacidade mineralogénica/osteogénica de fracções semi-purificadas e de moléculas purificadas de plantas terrestres, como o cardo ou o eucalipto, e de cianobactérias. A linha celular VSa13 obtida a partir de vértebras de dourada (Sparus aurata), que possui a capacidade de mineralização in vitro, foi usada para analisar o potencial mineralógenico dos extratos usados, e o opérculo do peixe-zebra foi usado para desenvolver e estabelecer um modelo in vivo adequado para analisar os efeitos de moléculas com atividade osteogénica (através do uso do calcitriol). Os nossos resultados demostraram a existência de um efeito mineralogénico moderado usando concentrações não tóxicas de extratos de cardo, de eucalipto e de algumas cianobactérias, enquanto que ácidos triterpénicos purificados a partir de amostras de eucalipto (como por exemplo o ácido betulónico, ursólico e oleanólico) aumentam até 6 vezes a deposição de mineral na matrix extracelular da linha celular VSa13. Os nossos resultados mostraram ainda que in vitro, a cinaropicrina, uma lactona sesquiterpénica abundante nos extratos de cardo, promovia um efeito anti-mineralogénico, o que foi mais tarde comprovado utilizando o nosso modelo in vivo. O efeito de compostos pro-mineralogénicos foi posteriormente analisado através do estudo do opérculo do peixe-zebra e os nossos resultados demonstraram que os extratos lipofílicos do cardo, como o ácido ursólico, o ácido oleanólico e a fracção de acetato de etílo da espécie #13 de cianobactérias, possuem efeitos osteogénicos. Apesar da capacidade osteogénica do ácido ursólico já ter sido analisada e comprovada por outros grupos usando um modelo animal de ratinho, a ação do ácido oleanólico, da cinaropicrina e de extratos de cianobactérias na formação óssea nunca tinha sido descrita. O uso de uma linha de duplos transgénicos que expressam uma proteína fluorescente sob o controlo dos promotores do osterix/sp7 ou da osteocalcina/oc2 tem sido determinante para tentar perceber os mecanismos responsáveis por esta atividade osteogénica e sendo a mesma abordagem atualmente aplicada ao estudo do efeito dos ácidos triterpenicos. Os dados gerados a partir das ferramentas in vitro e in vivo utilizadas neste trabalho não só demonstraram o potencial de recursos naturais (terrestres ou marinhos) para a descoberta de moléculas com efeito mineralogénico/osteogénico potencialmente relevantes para as indústrias farmacêutica ou alimentar, como também evidenciaram a importância do uso de animais modelos como o peixe-zebra para a análise do efeito destas moléculas

How microplastics and adsorbed pollutants affect zebrafish development?

A presença de microplásticos no ecossistema aquático é, nos dias de hoje, uma realidade extremamente preocupante que acarreta sérios riscos para o meio ambiente e para a saúde pública. A capacidade dos microplásticos de adsorverem poluentes orgânicos, como é o caso do benzo[α]pireno (BaP), levanta preocupações adicionais, pois cria uma nova rota de entrada de compostos tóxicos na cadeia alimentar. No entanto, o conhecimento atual sobre o impacto dos microplásticos, inalterados e/ou contaminados, nos organismos aquáticos é ainda insuficiente e requer estudos adicionais. O trabalho desenvolvido no âmbito desta tese pretende assim fornecer novos dados sobre os efeitos biológicos dos microplásticos utilizando como modelo o peixe-zebra (Danio rerio). Pequenos teleósteos, como é o caso do peixe-zebra, oferecem vantagens significativas relativamente aos modelos animais clássicos e são atualmente utilizados como organismos de primeira linha para avaliar os riscos ambientais associados aos compostos tóxicos presentes nos meios aquáticos. Estudos toxicológicos requerem o uso de materiais inertes e condições controladas, todavia, nenhum dos sistemas atualmente comercializados é adequado para avaliar o efeito tóxico dos microplásticos. Estes sistemas contêm componentes feitos de polímeros plásticos que podem libertar partículas plásticas micrométricas, lixiviar os constituintes químicos ou adsorver os compostos químicos em estudo. O sistema de aquários autônomo ZEB316 foi desenvolvido no âmbito deste trabalho com o objetivo de suprimir esta necessidade e de facultar uma solução económica e fácil de implementar que permita a realização de estudos toxicológicos de última geração. Este sistema é construído com materiais inertes e resistentes à corrosão e proporciona boas condições de alojamento através de um sistema eficiente de recirculação e filtragem da água. A avaliação dos parâmetros da água e do desempenho do crescimento dos peixes mostrou que o sistema ZEB316 oferece condições de alojamento comparáveis à dos sistemas comercialmente disponíveis. A maioria dos resultados obtidos no âmbito desta dissertação provêm da análise de imagens de microscopia de campo claro e/ou fluorescência. Embora o uso de imagens de microscopia seja comum na maioria dos laboratórios e permita obter uma quantidade considerável de informação, a análise destas imagens é geralmente um processo moroso, em parte devido à falta de ferramentas automáticas/semiautomáticas dedicadas que permitam a sua análise. Nesse sentido, desenvolvemos diversas macros para o software ImageJ, com o objetivo de reduzir o erro associado à análise pelo usuário, aumentando assim a reprodutibilidade dos dados e a padronização das metodologias experimentais. Uma vez que o foco deste trabalho está centrado no estudo da osteotoxicidade, é de salientar o desenvolvimento de um conjunto de macros específicas para esse fim e denominadas ZFBONE. Este conjunto de ferramentas permite aos usuários avaliar, a partir de imagens 2D, parâmetros morfométricos de várias estruturas ósseas (por exemplo, opérculo, raios e escamas da barbatana caudal), mas também a extensão e a intensidade das colorações específicas do osso. Além disso, outras macros foram desenvolvidas para outros fins, por exemplo, para analisar os vários parâmetros morfométricos relativos aos embriões de peixe ou para avaliar cortes histológicos. Uma vez desenvolvidos os meios e técnicas necessários para a execução dos ensaios toxicológicos, e subsequente análise dos resultados, procedeu-se à realização das várias experiências que visam compreender efeito biológico dos microplásticos e contaminates no peixe-zebra. Assim, larvas de peixe-zebra foram produzidas e mantidas no sistema previamente descrito, ZEB316, e expostas cronicamente, durante o seu desenvolvimento, a partículas de polietileno de 20- 27 μm, inalteradas (MP) ou contaminadas com benzo[α]pireno (MP-BaP). Estas partículas foram adicionadas à dieta dos peixes através de uma suplementação a 1% m/m. Apesar de não se ter registado qualquer alteração ao nível dos parâmetros morfológicos aos 30 dias pós-fertilização (dpf), a presença de MP e MP-BaP acabou por ter um efeito negativo no crescimento dos espécimes aos 90 e 360 dpf. A fecundidade relativa, a morfologia do ovo/embrião e a área do vitelo também sofreram um impacto negativo em peixes-zebra alimentados com MP-BaP. No que respeita ao estado geral do esqueleto, os peixes expostos a dietas experimentais contendo MP e MP-BaP sofreram um aumento significativo na incidência de deformações esqueléticas aos 30 dpf quando comparados com peixes alimentados com a dieta controlo, bem como um desenvolvimento anómalo da barbatana caudal e escamas, e uma diminuição da qualidade do osso aos 90 dpf. Um comprometimento da formação óssea intergeracional foi também observado na prole de espécimes expostos a MP ou MP-BaP, que se refletiu numa redução do osso opercular dos descendentes aos 6 dpf. Além de um claro efeito no desenvolvimento ósseo, a análise histológica do intestino revelou ainda um número reduzido de células caliciformes em peixes alimentados com dieta MP-BaP, um claro sinal de inflamação intestinal. Finalmente, a exposição das larvas a MP-BaP levou a um aumento da expressão de genes associados à via de resposta do BaP, ao mesmo tempo que impactou negativamente na expressão de genes envolvidos no estresse oxidativo. Os resultados obtidos indicaram um maior comprometimento do desenvolvimento ósseo no peixe-zebra quando sujeito a uma dieta contendo microplásticos contaminados com BaP (MP-BaP), por comparação com a dieta contendo microplásticos não contaminados (MP). Outros autores demostraram também que a presença de BaP afeta a formação das vértebras e o desenvolvimento generalizado do esqueleto, no entanto os mecanismos envolvidos nestes fenómenos permanecem pouco estudados. Desta forma, realizámos ensaios adicionais in vivo com o objetivo de avaliar os efeitos osteotóxicos do BaP durante o desenvolvimento e regeneração óssea em peixe-zebra. A exposição aguda de larvas de peixe-zebra entre os 3 e os 6 dpf ao BaP levou a uma redução do tamanho do osso opercular e uma diminuição quantitativa de células positivas para osteocalcina, indicando um efeito composto na maturação dos osteoblastos. Por sua vez, quando se trata de uma exposição crônica das larvas de peixe-zebra ao BaP, entre os 3 e os 30 dpf, verificou-se que o desenvolvimento do esqueleto axial é afetado, aumentando a incidência e gravidade das deformações esqueléticas. Em peixes jovens adultos, observou-se ainda que a exposição ao BaP afetou não só a mineralização dos raios da barbatana caudal e escamas recém-formados, como prejudicou também o seu padrão morfológico, fenómenos que têm por base uma remodelação óssea desequilibrada. Relativamente às análises de expressão genética de vários marcadores verificou-se que o BaP induziu a ativação das vias xenobióticas e metabólicas e impactou negativamente na formação e organização da matriz extracelular. Curiosamente, a exposição ao BaP regulou positivamente os marcadores de inflamação nas larvas e aumentou o recrutamento de neutrófilos. Uma interação direta entre neutrófilos e a matriz extracelular óssea, ou células responsáveis pela formação do osso, foi observada in vivo, o que sugere um papel dos neutrófilos nos mecanismos subjacentes à osteotoxicidade do BaP. Globalmente, os resultados obtidos no âmbito deste trabalho sugerem que a exposição crónica a microplásticos inalterados e/ou contaminados não prejudica apenas o crescimento dos peixes, mas também o seu desempenho a nível reprodutivo, saúde geral do seu esqueleto, e compromete a descendência por meio de efeitos intergeracionais. Além disso, este trabalho fornece novos dados sobre os principais mecanismos celulares e moleculares envolvidos na osteotoxicidade do BaP e aborda o possível papel dos neutrófilos na redução da resposta óssea inflamatória.The presence of microplastics in the aquatic ecosystem represents a major issue for the environment and human health. The capacity of organic pollutants such as benzo[α]pyrene (BaP) to adsorb onto microplastic particles raises additional concerns, as it creates a new route for toxic compounds to enter the food web. Current knowledge on the impact of pristine and/or contaminated microplastics on aquatic organisms remains insufficient, and this work aims at providing new insights by evaluating their biological effects in zebrafish (Danio rerio). The ZEB316, a standalone housing system built with inert materials, and a comprehensive set of ImageJ semi-automatic tools were first developed and optimized to perform state-of-the-art toxicological studies and obtain meaningful data from morphometric analysis of brightfield/ fluorescence images. Zebrafish larvae were exposed throughout their development to polyethylene microplastics, pristine or spiked with BaP, supplemented in the fish diet. While exposure up to 30 days post-fertilization only increased the incidence of skeletal deformities, long-term exposure to pristine/contaminated microplastics not only jeopardized fish growth, reproduction performance, and skeletal health, but it also caused an intergenerational effect. To further study the mechanisms underlying BaP osteotoxicity, several bone-related in vivo assays were used to evaluate the effects of waterborne exposure to BaP during bone development and regeneration. BaP inhibited osteoblast maturation and ECM mineralization and stimulated osteoclast activity, thus affecting bone remodeling. Transgenic and transcriptomic approaches suggested that besides the activation of xenobiotic and metabolic pathways, which may negatively impact extracellular matrix formation and organization, BaP activates inflammatory mechanisms that recruit neutrophils, which affect both osteoblast and osteoclast activity, possibly through a direct interaction of the neutrophils with the bone matrix. This work provides novel data on the effects of microplastics exposure during zebrafish development, in particular its osteotoxic effects, and gives new insights into the cellular and molecular players involved in BaP osteotoxicity.Marco Tarasco was supported by the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) through the PhD grant SFRH/BD/128634/2017 and COVID/BD/151848/2021 and by NEUBIAS-COST STSM program as part of action CA15124. This work was funded by FCT through projects UID/Multi/04326/2019, UID/00350/2020, UIDB/04326/2020, UID/MAR/00350/2013 and from the operational programs MAR2020 and COMPETE 2020 through projects OSTEOMAR MAR-02.01.01-FEAMP-0057 and EMBRC.PT ALG-01-0145-FEDER-022121

The zebrafish operculum: a powerful system to assess osteogenic bioactivities of molecules with pharmacological and toxicological relevance

Bone disorders affect millions of people worldwide and available therapeutics have a limited efficacy, often presenting undesirable side effects. As such, there is a need for novel molecules with bone anabolic properties. The aim of this work was to establish a rapid, reliable and reproducible method to screen for molecules with osteogenic activities, using the zebrafish operculum to assess bone formation. Exposure parameters were optimized through morphological analysis of the developing operculum of larvae exposed to calcitriol, a molecule with known pro-osteogenic properties. An exposure of 3 days initiated at 3 days post-fertilization was sufficient to stimulate operculum formation, while not affecting survival or development of the larvae. Dose dependent pro- and anti-osteogenic effects of calcitriol and cobalt chloride, respectively, demonstrated the sensitivity of the method and the suitability of the operculum system. A double transgenic reporter line expressing fluorescent markers for early and mature osteoblasts was used to gain insights into the effects of calcitriol and cobalt at the cellular level, with osteoblast maturation shown to be stimulated and inhibited, respectively, in the operculum of exposed fish. The zebrafish operculum represents a consistent, robust and rapid screening system for the discovery of novel molecules with osteogenic, anti-osteoporotic or osteotoxic activity.Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) [PD/BD/52425/2013, PD/00117/2012]European Commission (ERDF-COMPETE) [PEst-C/MAR/LA0015/2011]FCT [UID/Multi/04326/2013, PTDC/MAR/112992/2009

Screening of mineralogenic and osteogenic compounds in zebrafish—tools to improve assay throughput and data accuracy

Bone disorders affect millions of people worldwide and treatments currently available often produce undesirable secondary effects or have limited efficacy. It is therefore of the utmost interest for patients to develop more efficient drugs with reduced off-target activities. In the long process of drug development, screening and preclinical validation have recently gained momentum with the increased use of zebrafish as a model organism to study pathological processes related to human bone disorders, and the development of zebrafish high-throughput screening assays to identify bone anabolic compounds. In this review, we provided a comprehensive overview of the literature on zebrafish bone-related assays and evaluated their performance towards an integration into screening pipelines for the discovery of mineralogenic/osteogenic compounds. Tools available to standardize fish housing and feeding procedures, synchronize embryo production, and automatize specimen sorting and image acquisition/analysis toward faster and more accurate screening outputs were also presented.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Anti-osteogenic activity of cadmium in zebrafish

Among the many anthropogenic chemicals that end up in the aquatic ecosystem, heavy metals, in particular cadmium, are hazardous compounds that have been shown to affect developmental, reproductive, hepatic, hematological, and immunological functions in teleost fish. There is also evidence that cadmium disturbs bone formation and skeletal development, but data is scarce. In this work, zebrafish was used to further characterize the anti-osteogenic/osteotoxic effects of cadmium and gain insights into underlying mechanisms. Upon exposure to cadmium, a reduction of the opercular bone growth was observed in 6-days post-fertilization (dpf) larvae and an increase in the incidence of skeletal deformities was evidenced in 20-dpf post-larvae. The extent and stiffness of newly formed bone was also affected in adult zebrafish exposed to cadmium while regenerating their caudal fin. A pathway reporter assay revealed a possible role of the MTF-1 and cAMP/PKA signaling pathways in mechanisms of cadmium osteotoxicity, while the expression of genes involved in osteoblast differentiation and matrix production was strongly reduced in cadmium-exposed post-larvae. This work not only confirmed cadmium anti-osteogenic activity and identified targeted pathways and genes, but it also suggested that cadmium may affect biomechanical properties of bone.Portuguese Science and Technology Foundation (FCT) - UID/Multi/04326/2019 (CCMAR), PEst-C/MAR/LA0015/2011 (CCMAR); SFRH/BD/128634/2017 and SFRH/BD/52425/2013info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Preliminary Evaluation of Moniliformin as a Potential Threat for Teleosts

Aquaculture feed manufacturers and producers increasingly recognize the importance of mycotoxins, which contaminate plant-based meals used in compound aquafeeds, and their potential to negatively impact production. Though data on the worldwide occurrence of legislated mycotoxins e.g., trichothecenes and zearalenone (ZEN) are well documented, relatively little information is available regarding other mycotoxins also produced by Fusarium, notably moniliformin (MON). Given that MON is known to affect the survival, growth, skeletal formation and bone mineralization in terrestrial species, its widespread occurrence on maize and maize by-products typically used in aquaculture makes it relevant to study these parameters in teleost fish. In the present work we have tested the effect of MON exposure on survival, bone development and mineralization using zebrafish (Danio rerio) as a model species and fish derived osteo-chondroprogenitor cell line for in vitro studies. Moniliformin exposure did not decrease bone mineralization in zebrafish larvae or extracellular matrix mineralization in the mineralogenic cell line VSa13. Here, the minimal in vitro cytotoxicity concentration was found to be 1000 µg L−1 MON. Incidence of deformities was also not altered by MON at the concentration tested (450 µg L−1) although larval growth was affected, as shown by a decrease in the standard length of exposed specimens at 20 days post fertilization. Survival decreased significantly in larvae exposed to MON concentrations higher than 900 μg L−1. Influence of MON on survival and growth might be relevant for aquaculture industry. As MON is a water-soluble mycotoxin, its leaching from feed is highly probable, so MON assimilation into the surrounding aqueous environment should also be considered. Tested levels in fish larvae are within the reported occurrence levels of MON in commercial feed and plant meals

ZEB316: a small stand-alone housing system to study microplastics in small teleosts

Many anthropogenic chemicals and plastic debris end up in the aquatic ecosystem worldwide, representing a major concern for the environment and human health. Small teleosts, such as zebrafish (Danio rerio) and Japanese medaka (Oryzias latipes), offer significant advantages over classical animal models and are currently used as first-line organisms to assess environmental risks associated with many aquatic toxicants. Toxicological studies require the use of inert materials and controlled conditions. Yet, none of the available commercialized systems is adequate to assess the toxic effect of microplastics, because they contain components made of plastic polymers that may release micrometric plastic particles, leach manufacturing compounds, or adsorb chemicals. The ZEB316 stand-alone housing system presented in this study is meant to be a cost-effective and easy-to-built solution to perform state-of-the-art toxicological studies. It is built with inert and corrosion-resistant materials and provides good housing conditions through efficient recirculation and filtration systems. Assessment of water parameters and fish growth performance showed that the ZEB316 provides housing conditions comparable to those available from commercial housing systems.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

ZFBONE: an ImageJ toolset for semi-automatic analysis of zebrafish bone structures

The last decade has seen an increased interest in the discovery of compounds with bone anabolic activity to treat skeletal disorders such as osteoporosis and increase the well-being of patients. Due to the many technical advantages over classical rodent systems, zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used in screening pipelines, in particular those aiming at identifying osteoactive compounds with pharmacological potential. Because compound osteoactivity is mostly determined in zebrafish through the morphometric analysis of bone structures, image analysis, rather than screening assay implementation, molecule availability and image acquisition, represents a bottleneck to the screening throughput. The absence of auto/semi-automatic tools for image analysis of fish bone structures is also a limitation to a broader usage of zebrafish screening pipelines. We present here ZFBONE (for ZebraFish BONE), an open-source, freely available, user-friendly, rapid and reliable toolset, aiming at accelerating image analysis by automating the morphometric assessment of zebrafish bone structures, but also at increasing data accuracy by reducing operator bias. Tools included in ZFBONE allow users to assess, from 2D images, morphometric parameters of several bone structures (e.g. operculum, caudal fin rays and scales) but also the extent and the intensity of bone-specific colorations. ZFBONE has been developed using the open-source ImageJ software, to make it available to the whole zebrafish research community, but also to have it easily modifiable according to user demands. ZFBONE can also be used toward the standardization of zebrafish screening protocols in academia and industry.Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT)Portuguese Foundation for Science and Technology [UIDB/04326/2020]European Maritime and Fisheries Fund (EMFF/FEAMP) through the National Operational Programme MAR2020FCTPortuguese Foundation for Science and TechnologyEuropean Commission [SFRH/BD/128634/2017]NEUBIAS-COST STSM program [CA15124]French National Research AgencyFrench National Research Agency (ANR) [ANR-10-INBS-04]project OSTEOMAR [16-02-01-FMP-0057]info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Fin ray branching is defined by TRAP ⁺ osteolytic tubules in zebrafish

Significance Skeletal function is inherently linked to the correct shaping of the bones. However, how different cells regulate bone shaping remains unclear. The zebrafish fins are particularly suitable to study bone shaping, as bone rays undergo a simple bifurcation process, easily tracked in vivo. Here, we show that the bifurcation of a bone element relies on stitching and antistitching events, rather than on the splitting of a single unit. This report describes tartrate-resistant acid phosphatase-positive (TRAP +) osteolytic tubules and their role in bone bifurcation. Our study provides valuable insights into how cells coordinate to shape bones, thereby contributing to our understanding of bone degenerative and dysmorphic diseases and the identification of new therapeutic strategies

Novos insights sobre a osteotoxicidade do benzo[alfa]pirinete em zebrafish

Persistent and ubiquitous organic pollutants, such as the polycyclic aromatic hydrocarbon benzo[⍺]pyrene (BaP), represent a major threat to aquatic organisms and human health. Beside some well-documented adverse effects on the development and reproduction of aquatic organisms, BaP was recently shown to affect fish bone formation and skeletal development through mechanisms that remain poorly understood. In this work, zebrafish bonerelated in vivo assays were used to evaluate the osteotoxic effects of BaP during bone development and regeneration. Acute exposure of zebrafish larvae to BaP from 3 to 6 days post-fertilization (dpf) induced a dosedependent reduction of the opercular bone size and a depletion of osteocalcin-positive cells, indicating an effect on osteoblast maturation. Chronic exposure of zebrafish larvae to BaP from 3 to 30 dpf affected the development of the axial skeleton and increased the incidence and severity of skeletal deformities. In young adults, BaP affected the mineralization of newly formed fin rays and scales, and impaired fin ray patterning and scale shape, through mechanisms that involve an imbalanced bone remodeling. Gene expression analyses indicated that BaP induced the activation of xenobiotic and metabolic pathways, while negatively impacting extracellular matrix formation and organization. Interestingly, BaP exposure positively regulated inflammation markers in larvae and increased the recruitment of neutrophils. A direct interaction between neutrophils and bone extracellular matrix or bone forming cells was observed in vivo, suggesting a role for neutrophils in the mechanisms underlying BaP osteotoxicity. Our work provides novel data on the cellular and molecular players involved in BaP osteotoxicity and brings new insights into a possible role for neutrophils in inflammatory bone reduction.info:eu-repo/semantics/publishedVersio